Laboratoire MIPS

Vision 3D, traitement de l'image et développement pour la microscopie photonique

Caractérisation et déconvolution en imagerie de fluorescence

B. Colicchio, C. Cudel, A. Dieterlen, E. El Maalouf, O.Haeberlé
contact fluo 3D :  alain.dieterlen chez uha.fr

Mot-clés : Microscopie 3D, Fluorescence, Déconvolution, Monte-Carlo, réponse impulsionnelle optique, polynômes de Zernike. Keywords : 3D microscopy, deconvolution, Monte-Carlo, PSF analysis and modelisation, zernike moment, 3d fluorescence, digital signal analysis

Les thématiques abordées par cet axe de recherche concernent :
  • Déconvolution 3D et approche algorithmique : Monte-Carlo, déconvolution non-invariante...
  • Validation des outils d'analyse 3D en microscopie de fluorescence : standardisation.
  • Modélisation des systèmes imageurs : calcul de réponse impulsionnelle optique (PSF)
  • Caractérisation des systémes optiques : mesure de PSF

Généralités : formation de l'image, déconvolution et réponse impulsionnelle.

La microscopie de fluorescence 3D est un outil efficace d'analyse des échantillons biologiques vivants. Lors du processus d'acquisition de l'image g(x,y,z), l'objet f(x,y,z) est convolué avec la réponse impulsionnelle optique (RIO ou PSF pour 'point spread function' en anglais) h(x,y,z) du microscope :
convolution
Un bruit n(x,y,z), combinant statistiques gaussienne (électronique, numérique) et poissonienne (détection des photons), vient s'ajouter à cette opération. On voit que le processus de formation de l'image mène à une dégradation de l'image (flou, bruit...).
D'un point de vue général, l'amélioration de l'analyse des images 3D obtenues nécessite l'amélioration de l'appareil de mesure ou le développement d'outils de traitement du signal. La connaissance de la RIO et de l'image permettent d'envisager une amélioration de l'image par l'opération inverse (déconvolution). Cependant, ce problème inverse étant mal posé, une étape de régularisation est nécessaire et nécessite l'intervention de l'utilisateur. Par ailleurs, l'opération de convolution suppose la non-invariance spatiale de la RIO : la réponse impulsionnelle est identique quelquesoit le point de l'échantillon.

Les travaux de l'axe fluorescence 3D du laboratoire concernent l'amélioration des images grâce à des techniques de déconvolution associées à la connaissance de la réponse impulsionnelle du système. La mise au point d'algorithmes de déconvolution s'appuie ainsi sur un savoir faire acquis dans la mesure et le calcul (modélisation) de cette réponse impulsionnelle. L'automatisation de la procédure, rendant plus facile l'utilisation de tels algorithmes du point de vue utilisateur, est également un objectif.

Déconvolution assistée, RIO et standardisation.

Les algorithmes de déconvolution développés permettent de trouver automatiquement les paramètres de régularisation, habituellement fixés par l'utilisateur. Un préfiltrage est également utilisé pour améliorer la stabilité de ces algorithmes. Grâce à cette automatisation, les résultats obtenus sont moins subjectifs et présentent une meilleure reproductibilité.
La réponse impulsionnelle optique permet de caractériser les propriétés du système imageant. Dans le cas où la RIO est mesurée expérimentalement, des outils statistiques associés aux moments de Zernike sont utilisés pour décrire la RIO 3D et quantifier ses variations. Les polynômes de Zernike peuvent être utilisés pour traiter la RIO expérimentale : les caractéristiques du système sont préservées et le bruit est atténué. Ceci constitue une première étape vers la mise au point d'un protocole de standardisation.

Limites et perspectives

La microscopie de fluorescence 3D souffre de certaines limitations : perte de fluorescence dans le temps (photoblanchiment ou 'photobleaching'), phototoxicité ou encore influence des propriétés optiques de l'échantillon sur l'observation 3D.
Pour résoudre ce dernier problème, un couplage avec la microscopie tomographique diffractive est envisagé. En effet, l'hypothèse de non-invariance de la RIO est mise en défaut lorsque l'échantillon est inhomogène. Les algorithmes de déconvolution devraient prendre en compte les variations de la RIO. Un tel algorithme, basé sur une solution de type Monte-Carlo, a été développé au laboratoire. Le couplage entre la carte d'indice 3D, obtenue par tomographie diffractive, avec l'information de fluorescence devrait ouvrir la voie à de nouvelles possibilités en microscopie 3D.

Deconvolution 3D
Un exemple de déconvolution en microscopie de fluorescence. Avant et après traitement.

Publications



Colicchio B., Haeberlé O., Xu C., Dieterlen A., Jung G., "Improvement of the LLS and MAP deconvolution algorithms by automatic determination of optimal regularization parameters and pre-filtering of original data", Optics communications, 244(6), 37-49, (2005).
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