Mots-clés : microscopie 3D, tomographie diffractive, super résolution, microscope à synthèse d'ouverture, holographie numérique, optique de Fourier, imagerie 3D, mesure d'indice de réfraction.
Keywords : 3D microscopy, diffractive tomography, super-resolution, aperture synthesis microscopy, digital holography, Fourier optic, 3D imagery, refractive index measurement.
Généralités
La microscopie de fluorescence a fait d'importants progrès ces dernières années : une technique comme la
microscopie confocale est devenue routinière pour l'imagerie des échantillons marquées et la microscopie
STED ("stimulated emission depletion" ou "Déplétion par émission stimulée") permet d'atteindre des résolutions
inégalées (inférieures à 50 nm). Les techniques de fluorescence ne sont cependant pas exemptes de problèmes
: photoblanchiment, phototoxicité, difficultés voire impossibilité de marquage. À ceci s'ajoute la complexité
du montage expérimental et de l'utilisation dans le cas du STED.
À l'inverse, la microscopie photonique sur échantillon non marqué n'a pas connu de tels progrès.
Un des axes du laboratoire concerne la microscopie optique diffractive tomographique. C'est une
technique permettant de visualiser en 3D un échantillon microscopique. Plus
précisément, il est possible de mesurer l'indice de réfraction complexe (i.e.
l'absorption et l'indice) d'un
échantillon semi-transparent de façon quantitative et en trois dimensions. Par ailleurs, les résolutions
latérale et longitudinale atteintes par ce microscope sont supérieures à celles du microscope photonique classique.
Les échantillons ne nécessitent aucun traitement particulier, notamment aucun marquage.
Principe
La tomographie.
La tomographie consiste à restituer un objet à partir de "coupes" (mesures extérieures) de cet objet. Dans le cas de la tomographie assistée par ordinateur (tomodensimétrie), utilisée dans les scanners, il s'agit de restituer l'objet à partir de mesures extérieures à l'objet : une onde d'illumination traverse l'objet inconnu et la modification apportée par l'objet à cette onde est enregistrée sur un capteur. Chaque pixel du capteur enregistre l'intensité, ce qui donne une information sur l'absorption intégrée sur l'épaisseur de l'objet (intégrale en ligne). L'ensemble des intégrales en ligne enregistrées par le capteur est une projection. En tournant l'objet -ou de façon équivalente l'ensemble source/capteur-, on obtient différentes projections. Ces nouvelles projections apportent de nouvelles informations sur l'objet.
Le problème inverse, consistant à restituer l'objet à partir de l'ensemble des projections, est appelé rétroprojection.
La tomographie diffractive.
La tomographie diffractive nécessite également l'enregistrement de projections de l'objet, mais les mesures prennent en compte la diffraction et sont effectuées en phase et en amplitude.
Cette technique de microscopie repose sur 3 points :
Le modèle direct, qui repose sur une approximation linéaire en champ diffracté, a été proposé par Wolf [Wolf1969].
L'enregistrement en phase et en amplitude est actuellement réalisé grâce à un montage holographique à décalage
L'image 3D, reconstruite numériquement en quelques minutes, fournit l'indice de
réfraction complexe relatif. Deux volumes 3D sont donc obtenus, fournissant une information différente
sur l'échantillon (coefficient d'absorption et indice de réfraction relatif). Les champs observés sont de
l'ordre de 50 µm³ avec une bande passante latérale théorique (4*ON)/λ
avec λ=633
nm pour une source de type Hélium-Néon et en utilisant un objectif et un condenseur à immersion (ouverture numérique=ON=1,4). Les fréquences sont en outre pleinement transmises, contrairement aux systèmes en lumière incohérente.
Montage expérimental : holographie à décalage de phase et tomographie
Le microscope tomographique diffractif repose sur un montage holographique à
décalage de phase afin de mesurer l'amplitude et la phase du champ diffracté
par l'objet. La source cohérente est divisée en 2 faisceaux injectés dans 2 fibres optiques.
Applications typiques : imagerie d'objet (semi) transparents à haute résolution
Le microscope tomographique fournit deux images : un volume 3D pour l'absorption, et un volume 3D pour l'indice de réfraction. En plus de l'imagerie "classique" d'absorption (3D),Cette technique permet donc typiquement d'imager en 3D des objets présentant peu de contraste en champ large, ou des sites difficilement marquables par un fluorophore en imagerie confocale : l'information obtenue vient alors compléter celle obtenue par confocal.
Profilométrie multiangle et couplage transmission-réflexion
Le microscope fonctionne aujourd'hui de façon routinière en mode transmission
au laboratoire et l'intérêt de ce mode d'imagerie est étudié sur différents échantillons, notamment en biologie [Simon2010]. Une version du microscope a été développée en réflexion et a permis de montrer un gain de résolution selon la profondeur [Sarmis2010], comparée à la version en transmission.
Le couplage transmission-réflexion et l'utilisation du microscope en topographie ont été réalisée durant la thèse de H. Liu. Un prototype compact et rapide a également été conçu. Il combine un montage à acquisitions rapides (hors-axe) et une reconstruction s'appuyant sur GPU plutôt que processeur (CUDA).
Les acquisitions peuvent être désormais réalisées en moins de 10s (temps essentiellement limité par la caméra actuelle), et la reconstruction en moins d'une demi seconde.